1.前言

香豆酸具有廣泛的藥理作用，預防心血管疾病、抗氧化、抗菌消炎、保護心臟、利肝利膽、及抗病毒等功效。因此，對香豆酸廣泛應用于食品、化妝品、醫藥等領域。

而針對甘蔗皮渣中的對香豆酸檢測，由于不同產地、不同品種的甘蔗皮中活性成分的類型、含量均存在差異，因此，建立甘蔗皮中對香豆酸的高效液相色譜定性定量檢測方法對于農副產品中對香豆酸的質量控制非常重要。即將實施的“GB/T 40833-2021甘蔗皮渣中對香豆酸檢測方法高效液相色譜法”標準中給出了甘蔗皮渣中的對香豆酸的樣品預處理和HPLC分析測試方法。

依利特使用最新推出的EClassical 3200液相色譜儀和經典的Supersil ODS2色譜柱，為甘蔗皮渣中對香豆酸檢測提出了分析檢測解決方案，供相關人員參考使用。

2.儀器設備與試劑

表2-1  飲料中的山梨酸含量檢測HPLC系統標準配置

表2-2 前處理所需設備

3.甘蔗皮渣中對香豆酸檢測

3.1 樣品制備

3.1.1 甘蔗皮渣粉末，置于80℃烘箱中烘干2小時，保存待用。

3.1.2 稱取0.20g（精確至0.01g）甘蔗皮渣樣品和梭形轉子一同放入25mL圓底燒瓶中，移取10mL 2mol/L氫氧化鈉溶液，輕輕搖晃使樣品和溶劑混合均勻，調節磁力攪拌器使轉子能夠帶動溶液在室溫下充分攪拌6h。

3.1.3 取下圓底燒瓶將溶液倒入放有兩層中速定量濾紙的抽濾裝置中，過濾，取5mL 2mol/L氫氧化鈉溶液分三次加入圓底燒瓶中沖洗內壁，洗液全部倒入抽濾裝置中，搖勻。

3.1.4 將濾液倒入100mL燒杯中，用少量（2mL）純水溶液清洗抽濾瓶，洗液并入燒杯中。移取4.0mL 6mol/L鹽酸溶液充分搖勻后再逐滴加入6mol/L鹽酸溶液調節PH至2.0左右，用少量（1mL）純水沖洗PH計電極，洗液并入燒杯中。

3.1.5 將上述酸性溶液轉入25mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度，混勻后以8000r/min的轉速離心5min，取部分溶液用0.45μm針筒式水相過濾器過濾，即為試樣液，待測。

3.2 標準曲線的制作

對香豆酸標準儲備液（1.0mg/mL）：準確稱取對香豆酸對照品25mg（精確至0.1mg）于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.0mg/mL的標準品儲備液，放置于4℃冰箱避光保存，有效期為1個月。

對香豆酸系列標準工作液：準確移取對香豆酸標準儲備液（1.0mg/mL）40μL、0.20mL、0.80mL、1.00mL、4.00mL、8.00mL、10.00mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容并搖勻。該校準系列濃度分別為4.0μg/mL、20.0μg/mL、80.0μg/mL、100μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL臨用時配制。

3.3  色譜條件

流動相：A：甲醇 B：0.1%乙酸水溶液

色譜柱：Supersil ODS2 5μm 4.6×250mm

流量：1.0mL/min

檢測波長：254nm

進樣體積：10μL

柱溫：30℃

4.測試（實驗）結果

4.1 標準曲線配制與線性相關系數

參照3.2方法將標準系列工作液分別注入10 μL于液相色譜儀中。測定相應的保留時間和峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

圖4-1  對香豆酸標準曲線

對香豆酸標準曲線方程：y=7.5504x+12.556，R2=0.9999

4.2 樣品液相色譜分析結果

按照3.1和3.2分析方法，分析制備好的樣品和標準品溶液，結果如下：

圖4-2 對香豆酸標準品色譜圖（濃度：1000μg/mL）

圖4-3 樣品典型色譜圖表

4-1 樣品色譜圖數據

通過計算得到樣品中對香豆酸含量為39.29g/kg。

4.3 連續進樣數據

4.4 加標回收率及檢出限驗證

準確在三份0.2g樣品中分別加入0.5mL、1.0mL、1.5mL1000μg/mL對香豆酸標準品溶液，對應0.20g樣品稱樣量加標量分別為2.5g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg，后續與樣品制備過程相同，以樣品為本底值分別計算得到的回收率如下：

表4-2 3份樣品加標回收率

參考基線噪聲：5×10^-5V，4.0μg/mL對照品峰高為2.80mV。以3倍和10倍基線噪聲信號確定儀器檢出限和定量限，甘蔗皮渣試樣稱取量為0.2002g，計算方法檢出限和定量限，結果如下：

表4-3 檢出限和定量限結果

5.結論

本實驗按照標準“GB/T 40833-2021甘蔗皮渣中對香豆酸檢測方法高效液相色譜法”對甘蔗皮渣中對香豆酸進行分析檢測，并對該方法進行了系統驗證。測試結果數據符合標準要求。驗證結果表明：該系統穩定性良好，定量結果準確。